اسپکتروفتومتر نور مرئی

اسپکتروفتومتر (Spectrophotometer) دستگاهی است که جذب یا عبور طول موجهای مشخصی از انرژی تابشی (نور) از یک آنالیت را در یک محلول مشخص می سازد. به دلیل تفاوت در تعداد و آرایش گروهها، پیوندهای دوگانه اتمهای کربن در هر مولكول نور را در طول موجهای خاص با الگوی طیف یگانه جذب می نماید. بر اساس قانون بير - لامبرت ( Beer - Lambert ) مقدار نوری که در این طول موج مشخص جذب می شود مستقیما با غلظت آن نمونه شیمیایی متناسب است. اسپکتروفتومترهای مرئی و فرابنفش رایج ترین دستگاههای جذب سنجی در مراکز تشخیصی و آزمایشگاهی هستند.

در آزمایشگاه ها، بخش اعظم اندازه گیری ها بر اساس واکنشهای جذب سنجی صورت می پذیرد. فعالیت اکثر آنزيمها، تری گلیسیریدها، کلسترول، لیپوپروتئینها، قند، کراتینین، اوره، و طیف وسیعی از آناليت ها کاربردهای بالینی و تحقیقاتی، طیف وسیعی از داروها و بخش گسترده ای از متابولیت ها با اسپکتروفتومتری قابل سنجش هستند. بررسی ساختمان مولکولی، شناسایی ترکیبات، مقایسه ساختمانها، یافتن طول موج ماکزیمم جذب و ... از دیگر کاربردهای اسپکتروفتومتری در مسایل تحقیقاتی است.

اجزاء دستگاه اسپکتروفتومتر نور مرئی

شش قسمت اصلی در ساختمان اسپکتروفتومترها وجود دارد که عبارتند از:

منبع نور (Light Source)
تكفام ساز (Monochromator)
متمرکز کننده پرتو (Focusing device)
محل نمونه (Cuvet)
آشکار ساز (Detector)
دستگاه نمایش خروجی (Display Device)
منبع نور (Light Source)

منبع نور در اثر افزایش حرارت به کمک الكتريسيته در یک لامپ تأمین می شود. شرایط اصلی این منبع، شدت کافی، پایداری و پیوستگی اجزاء آن است. برای تأمین نور مرئی به منظور اندازه گیری محلولهای نسبتا رقیقی که تغییر در شدت رنگشان متناسب با تغيير در غلظتشان است، معمولا از لامپهای تنگستن (با طول موج تولیدی بین ۲۰۰ – ۹۹۰ نانومتر) استفاده می شود. برای تولید پرتوهای فرابنفش غالبا از لامپهای هیدروژنی یا دوتریومی (با طول موج تولیدی ۲۰۰- ۴۵۰ نانومتر) بهره گرفته میشود. لامپ های دوتریومی معمولا پایدارترند و طول عمر بیشتری نسبت به لامپهای هیدروژنی دارند. اسپکتروفتومترها بر اساس تعداد باریکه های نوری که به آشکار ساز دستگاه می رسد به دو نوع تک پرتویی و یا دو پرتویی تقسیم میشوند. در دستگاههای تک پرتو یک جایگاه برای محلول و یا بلانک وجود دارد و جذب محلول بصورت مجزا آشکار و ثبت میگردد. در دستگاههای دو پرتو دو جایگاه منظور شده است. پرتو تابش شده بطور خودکار مجزا شده و از محلول بلانک و نمونه همزمان عبور میکند. معمولا حساسیت دستگاههای دو پرتویی از تک پرتویی بیشتر است

تکفام ساز (Monochromator)

این قسمت دستگاه، پرتو چند فام را به پرتو تکفام تبدیل می کند. این عمل ممکن است توسط منشور یا سیستم گریتینگ انجام شود. فیلترها شیشه های رنگی هستند که بخش اعظم پرتوها را جذب کرده و فقط طول موجهای محدودی را عبور می دهند. فیلترها باید پرتویی را که آنالیت جذب میکنند از خود عبور دهند. برای انتخاب نوع فیلتر برای سنجش محلولهای رنگی می توان از جدول زیر استفاده کرد. منشورها و سیستم گریتینگ بر اساس اختلاف ضریب شکست میتوانند طول موجهایی حتی با پهنای0.1 نانومتر تولید کنند. سیستم گریتینگ در اصل یک صفحه صیقلی است که تعداد زیادی خطوط نازک و موازی بر روی آن حک شده و کار منشور را به نحو بهتری انجام میدهد.

متمرکزکننده پرتو (Focusing device)

با ترکیبی از عدسیها، شکاف بین دو تیغه باریک فلزی و أنينه ها در سرتو تایش، پرتوها موازی می شوند و با تنظیم عرض شكاف می توان عرض پرتو را تنظیم کرد. هر قدر و شکاف تور بکار رفته کمتر باشد، کیفیت پرتوها بهتر خواهد بود.

محل نمونه ((Cuvet

كووت ها (Cuvets) قسمتی از دستگاه هستند که نمونه مورد نظر یا بلانک در آن قرار میگیرد.این بخش معمولا بصورت استوانه یا مستطیلی بوده، از شیشه، کوارتز با پلاستیک ساخته شده است. كووت های پلاستیکی و شیشه ای، برای محدوده مرنی بکار می روند. بدلیل جذب پرتوهای با طول موج کمتر از ۳۵۰ نانومتر توسط كووت های شیشه ای برای محدوده فرابنفش از كووت های گرانقیمت کوارتزی یا سیلیسی استفاده می شود.

آشکار سازها (Detectors)

آشکارسازها دستگاههایی هستند که یک نوع از انرژی را به نوع دیگری تبدیل میکند و معمولا به سه گروه اصلی تقسیم میشوند: ۱- فوتوالکتریکی ۲- فتوشیمیایی ۳- حرارتی. در دستگاههای اسپکتروفتومتر از آشکار سازهای فتوالکتریکی استفاده می شود. فتوسل و فتوتیوب از ساده ترین آشکارسازها می باشند. فتوترانزیستورها و فتودیودها نیز برای این منظور استفاده میشوند. برای اندازگیری های ضعیف از (PMTs) Phottinuultiplier Tubes بهره گرفته میشود. PMTs ها سریعتر جواب می دهند و علاوه بر حساسیت بالا با دوام تر از سایر آشکارسازها هستند. روش دیگر استفاده از آرایه دیودی (deoide array) است که در آن نور را پیش از رسیدن به مونوکروماتور از نمونه می گذرانند.

دستگاه نمایش خروجی (Display Device)

این قسمت می تواند یک گالوانومتر، صفحه ثبات، اسیلوسکوپ یا صفحه نمایشگر کامپیوتر با نرم افزارهای متنوع باشد.

خطاهای موجود

بمنظور اطمینان یافتن از صحت قوانین بیر - لامبرت در محدوده غلظت های مورد سنجش، باید از منحنی کالیبراسیون خطی استفاده شود. انحراف های احتمالی از این قانون باعث بر هم خوردن کالیبراسیون دستگاه میشود. این انحرافها میتواند در اثر تغييرات شیمیایی در نمونه باشد که معمولا در اثر غلظت بالای نمونه، اثر pH با تشكيل كمپلكس ها ایجاد می شوند.

قانون بیر - لامبرت برای نور کاملا تکفام صادق است. بنابراین دقیق نبودن خروجی تکفام ساز و تنظیم نبودن شکافها ممكن است باعث خطا شود، این مورد زمانی حادتر می شود که طول موج مورد استفاده در ناحیه ای از طیف باشد که در آن، نمونه مورد نظر نسبت به تغييرات طول موج بیشتر حساس است (یعنی تغییرات کسی در طول موج، تغییرات زیادی را در مقدار جذب نور ایجاد کند).

تجمع بخار تنگستن روی سطح داخلی و با رسوبات روی سطح خارجی لامپ می تواند باعث پایین آمدن دقت نتایج شود. بنابراین باید به صورت دوره ای لامپها را مورد بازبینی قرار داد و در صورت لزوم آنها را عوض کردہ دیگر مشکلات و خطاهای موجود عبارتند از وجود پرتوهای زاید (Stray Light) سيستم، پاسخ غیرخطی آشکار ساز و تقویت کننده و نوسانات ناخواسته در ولتاژ تغذیه که روی خروجی دستگاه اثر می گذارد. بدین منظور باید از دستگاههای تثبیت کننده ولتاژ استفاده کرد.

ملاحظات فنی و اقتصادی

هنگام تهیه اسپکتروفتومتر توجه به نکات ذیل حائز اهميت است:
تکرار پذیری نتایج
میزان دقت دستگاه در مقدار طول موج، خواندن میزان جذب یا عبور
محدوده طول موج دستگاه
پهنای باند قطعه ای از طيف جدا شده توسط تكفام ساز که بستگی به دقت گریتینگ و پهنای شكاف عبور نور داشته و برحسب nm (نانومتر) نوشته می شود. این عدد هر چه کمتر باشد دستگاه گرانتر خواهد بود. برای کارهای معمولی عدد 8 نانومتر مناسب بوده و برای کارهای تحقیقاتی 1.8-4 نانومتر انتخاب می شود.
قابلیت تصحيح خط پایه به صورت خودکار (خط پایه: خط صفر در یک محدوده طول موج)
تكفام ساز: نوع تکفام ساز میتواند Littrow با Czerny Tuner (چرنی ترنر) باشد که نوع دوم گرانتر است.
نوع گریتینگ و ظرافت در ساخت آن در دقت طول موج تاثیر دارد. مثلا Grating نوع Holographic و تعداد خطوط line/nm۱۲۰۰، حداقل ویژگی است که در اغلب اسپکتروفتومترها رعایت می شود.
Stray Light: پرتوهای زاید که در محدوده پهنای باند نبوده و از تکفام ساز عبور می کنند. این عدد هر چه کمتر باشد دستگاه خطی تر و دقیق تر عمل میکند. حساس ترین و گرانترین قسمت یک اسپکتروفتومتر تکفام ساز آن است که برای طراحی و ساخت آن از قطعات اپتیکی حساس مانند گریتینگ آینه ها و فیلترهای با کیفیت بالا استفاده میشود. تكفام سازی که پرتو زايد آن کمتر است گرانتر است و اصولا مهمترین عامل برای تعیین کیفیت و قیمت یک اسپکتروفتومتر عدد Stray light آن است.
تک یا دو پرتوی بودن اسپکتروفتومتر
ارتباط با رایانه و توانایی برنامه نرم افزاری آن
نوع لامپ ها و طول عمر آنها